卡梅德生物技术快报｜布鲁氏菌 Bp26 蛋白抗体制备与鉴定实验实现

摘要本文基于杂交瘤技术完整实现布鲁氏菌 Bp26 蛋白单克隆抗体制备并完成抗体亚类、特异性、敏感性、稳定性等生物学鉴定提供可复现的实验流程、参数与结果为生物研发人员提供技术参考。1 实验背景与目的布鲁氏菌 Bp26 蛋白为保守性免疫原蛋白是疫病检测的关键靶标。本实验旨在制备高特异性、高稳定性的 Bp26 蛋白单克隆抗体建立标准化制备流程为后续检测方法建立提供核心原料。2 实验材料与仪器实验动物BALB/c 小鼠细胞株骨髓瘤细胞试剂弗氏佐剂、PEG1450、HAT 培养基、ELISA 试剂盒等仪器酶标仪、电泳仪、层析系统、细胞培养箱等。3 Bp26 重组蛋白表达与纯化3.1 重组质粒构建将 Bp26 基因克隆至 pET 系列载体转化后酶切鉴定测序确认序列正确。3.2 蛋白诱导表达将重组质粒转化至 BL21 (DE3) 菌株37℃培养至 OD6000.6-0.8加入 IPTG 诱导优化诱导条件实现高效表达。3.3 蛋白纯化收集菌体超声破碎离心取上清通过镍亲和层析柱纯化洗脱液超滤浓缩SDS-PAGE 检测纯度BCA 法测定浓度。结果获得高纯度 Bp26 重组蛋白无明显降解浓度满足免疫需求。4 动物免疫选取健康小鼠分为免疫组与对照组免疫组按 0d、21d、35d、49d 进行免疫抗原剂量 50μg / 只首次免疫用完全佐剂后续用不完全佐剂末次免疫后 7d 采血测效价。结果免疫小鼠血清抗体效价显著高于对照组达到细胞融合要求。5 细胞融合与杂交瘤细胞筛选5.1 细胞融合取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞按 5:1 比例混合37℃加入 PEG 融合 2min缓慢加入培养基终止融合离心重悬。5.2 选择性培养融合细胞接种于 96 孔板HAT 培养基培养 7d换 HT 培养基继续培养。5.3 阳性克隆筛选采用间接 ELISA包被浓度 1μg/mL上清 1:10 稀释以 OD450 值≥2.1 倍阴性对照为阳性判定标准。5.4 亚克隆阳性孔采用有限稀释法连续 3 次亚克隆获得单克隆细胞株。结果成功获得多株稳定分泌抗 Bp26 蛋白单抗的杂交瘤细胞株。6 单克隆抗体生物学鉴定6.1 抗体亚类鉴定使用试剂盒测定结果为 IgG2a 型轻链 κ 型。6.2 特异性鉴定与对照蛋白进行 ELISA 检测无交叉反应特异性良好。6.3 敏感性鉴定抗原梯度稀释抗体最低检测限达到 ng 级水平。6.4 稳定性鉴定细胞株连续传代 15 代上清效价无显著下降稳定性优异。6.5 免疫学活性鉴定Western Blot 显示抗体可特异性结合目的蛋白条带清晰。7 抗体批量制备与纯化采用小鼠腹腔诱生腹水法预处理小鼠后注射杂交瘤细胞收集腹水经辛酸 - 硫酸铵沉淀法纯化Protein G 柱进一步精制纯化后抗体纯度 95%活性符合使用要求。8 技术关键点与问题解决8.1 融合效率低优化 PEG 浓度与融合时间控制细胞状态提升融合成功率。8.2 非特异性结合优化包被浓度、封闭液与洗涤条件降低背景值。8.3 细胞株不稳定增加亚克隆次数早期冷冻保存避免细胞变异。9 实验结论与技术价值本实验成功建立布鲁氏菌 Bp26 蛋白单克隆抗体制备技术体系制备的抗体各项指标优异可用于免疫检测方法开发。该流程参数明确、可复现性强适用于生物公司研发与实验室研究可推广至其他蛋白单抗制备项目。10 后续研发方向基于本抗体优化快速检测试纸条建立定量检测 ELISA 方法开展抗体人源化改造拓展应用场景优化大规模纯化工艺降低生产成本。参考文献罗意马春慧郑福英等。布鲁氏菌 Bp26 蛋白单克隆抗体制备及生物学鉴定 [J]. 中国农业大学学报2025, 30 (7): 139-149.